Spektrofotometri UV

spektrofotometer uv-vis

Spektrometer absorbsi adalah sebuah instrumen untuk mengukur absorbsi/penyerapan cahaya dengan energi (panjang gelombang) tertentu oleh suatu atom/molekul. Spektrofotometer dikembangkan beberapa puluh tahun lalu untuk keperluan para fisikawan dan kimiawan dalam mempelajari struktur molekul dan mengembangkan dengan teori molekul. Kini, spektrofotometer juga banyak digunakan untuk berbagai seperti studi bahan, lingkungan ataupun untuk mengontrol suatu proses kimiawi dalam industri. Amersham Biosciences adalah perusahaan intrumentasi yang memfokuskan diri dalam pengembangan spektrofotometer untuk keperluan penelitian Biologi molekuler. Setiap laboratorium Biologi pasti memiliki spektrofotometer sebagai salah satu tools modernnya.

Proses Absorbsi

Absorbsi cahaya oleh suatu molekul merupakan suatu bentuk interaksi antara gelombang cahaya (foton) dan atom/molekul. Energi cahaya diserap oleh atom/molekul dan digunakan oleh elektron di dalam atom/molekul tersebut untuk bertransisi ke tingkat energi elektronik yang lebih tinggi. Absorbsi hanya terjadi jika selisih kedua tingkat energi elektronik tersebut (ΔE = E₂ – E₁) bersesuaian dengan energi cahaya (foton) yang datang, yakni

ΔE = E_foton.

 Untuk molekul organik, dalam banyak hal, absorbsi cahaya UV/Vis (ultraviolet/visible) terjadi pada group fungsional (kromofor) yang mengandung elektron-elektron valensi. Proses absorbsi cahaya UV/Vis berkaitan dengan promosi elektron dari satu orbital molekul dengan tingkat energi elektronik tertentu ke orbital molekul lain dengan tingkat energi elektronik yang lebih tinggi. Transisi elektronik tersebut biasanya adalah σ ® σ^* σ^*atau n ® σ^* (bersesuaian dengan energi cahaya UV), dan π ® π^*atau n ® π ^* (bersesuaian dengan energi cahaya Vis), seperti ditunjukkan dalam gambar di bawah ini.

Absorbansi dan Molar absorbsivitas (Koefisien molar ekstinsi)

Besar penyerapan cahaya (absorbansi) dari suatu kumpulan atom/molekul dinyatakan oleh Hukum Beer-Lambert.

1.      Hukum Lambert menyatakan bahwa proporsi berkas cahaya datang yang diserap oleh suatu bahan/medium tidak bergantung pada intensitas berkas cahaya yang datang. Hukum Lambert ini tentunya hanya berlaku jika di dalam bahan/medium tersebut tidak ada reaksi kimia ataupun proses fisis yang dapat dipicu atau diimbas oleh berkas cahaya datang tersebut. Dalam hal demikian, intensitas cahaya yang keluar setelah melewati bahan/medium tersebut dapat dituliskan dalam bentuk sederhana sbb.:

I = T x I₀,

dimana I adalah intensitas berkas cahaya keluar, I₀ adalah intensitas berkas cahaya masuk/datang, dan T adalah transmitansi. Jika transmisi dinyatakan dalam prosentase, maka

%T = (I/I₀) x 100          (dalam satuan %)

2.    Hukum Beer menyatakan bahwa absorbansi cahaya berbanding lurus dengan dengan konsentrasi dan ketebalan bahan/medium. Yakni

A = ε c l

dimana ε adalah molar absorbsitivitas untuk panjang gelombang tertentu, atau disebut juga sebagai koefisien ekstinsif (dalam l mol^-1 cm^-1)),

 c adalah konsentrasi molar (mol l^-1),

 l adalah panjang/ketebalan dari bahan/medium yang dilintasi oleh cahaya (cm).

Kombinasi dari kedua hukum tersebut (Hukum Beer-Lambert) dapat dituliskan sebagai berikut:

%T = (I/I₀) x 100 = exp(− ε c l)

atau

A = log (I₀/I) = ε c l.

Gambar di bawah menunjukkan plot %T vs. c dan A vs. c. Bentuk persamaan terakhir menyatakan sebuah hubungan penting, yakni absorbansi A memiliki hubungan linier dengan konsentrasi c (A µ c) dan dapat ditentukan dengan mengukur ratio antara intensitas cahaya setelah melewati bahan/medium dan intensitas sebelum melewati bahan/medium.

           

Karena sifat hubungan linieralitas antara A dan c, penentuan konsentrasi bahan/sampel dapat dilakukan dengan lebih mudah jika bekerja dengan absorbansi A daripada bekerja dengan transimisi %T. Konsentrasi dapat ditentukan lewat perkalian atau pembagian sederhana dari nilai koefisien molar ekstinsi yang telah diketahui. Tabel di bawah ini menunjukkan nilai koefisien molar ekstinsi untuk deoxynucleoside triphosphates:

Deoxynucleoside  triphosphates	Absorbsi maksimal (lmaks)	koefisien molar ekstinsi εmaks (10-3)
dATP	259	15.4
dCTP	271	13.0
dGTP	252	13.6
dTTP	267	9.9

Nilai konsentrasi dapat dihitung dengan mudah dengan menggunakan persamaan Beer-Lambert di atas.

            Beberapa molekul, termasuk juga DNA seperti terlihat dalam Tabel di atas, memiliki absorbansi yang tinggi. Pada daerah dengan konsentrasi tinggi, kurva absorbansi tidak lagi berbanding lurus dengan konsentrasi tetapi mengalami deviasi akibat saturasi. Untuk mendapatkan akurasi yang lebih baik, sebaiknya pengukuran dilakukan pada daerah absorbansi A < 2 yang dapat dicapai lewat pengenceran.

Instrumentasi

Gambar di bawah ini menunjukkkan skema dari konstruksi spektrofotometer yang paling sederhana, yang terdiri dari 

1. sumber cahaya  
2. monokromator, yang berfungsi sebagai penyeleksi cahaya dengan panjang gelombang (energi) tertentu.  
3. kompartemen sampel  
4. detektor dan pengukur intensitas cahaya.

Bergantung pada daerah spektum yang akan dieksplorasi, spektrofotometer ada yang dirancang hanya memiliki sumber cahaya tampak saja (Vis), dan ada yang dirancang memiliki sumber cahaya tampak (Vis) dan ultraviolet (UV). Untuk spektrometer Vis, sumber cahaya yang digunakan biasnya adalah lampu tungsten halogen (W). Spektrometer UV-Vis menggunakan kombinasi lampu tungsten halogen dan lampu deuterium (D₂). Pada beberapa model spektrofotomer digunakan lampu Xenon. Meski spektrofotomer dengan lampu Xenon hanya bisa mengkover sebagian daerah UV, yakni pada daerah panjang gelombang lebih besar dari 300 nm, tetapi spektrofotometer ini menawarkan nilai ekonomis yang lebih baik karena lampu Xenon relatif lebih panjang umur hidupnya dan lebih murah harganya. Tabel di bawah ini menunjukkan beberapa tipe spektrofotometer dan jenis lampu yang digunakan.  

Tipe	Jenis lampu
Ultrospec 6300, 5300, 4300, 3300, 1100 pro UV/Visible Spectrophotometer	D2 dan W
Ultrospec 3100, 2100 pro UV/Visible Spectrophotometer	Xenon

Pada awalnya, kebanyakan spektrometer dibangun dengan teknik optika sinar ganda (double beam optics). Dengan berkembangnya dunia mikroprosesor secara pesat, kemampuan kerja sebuah spektorofotometer dapat dioptimalkan dengan mengintegrasikan sebuah mikroprosesor ke dalam sistem spektrofotometer tersebut. Selain menggantikan fungsi kontrol analog dalam spektrofotometer model lama, pemanfaatan mikroprosesor menghadirkan fungsi-fungsi baru. Seperti terlihat dalam sekma di bawah ini, mikroprosesor menjadi “otak” dari sebuah spektrofotomer yang berfungsi.

• mengontrol komponen optik dan mekanik

• menyimpan dan melakukan operasi aritmatik,

• melakukan komunikasi, baik satu arah (lewat display atau printer) maupun dua arah (dengan komputer)

Dengan memanfaatkan kemampuan sebuah mikroprosesor dalam menyimpan memori dan melakukan operasi aritmatik, spektrofotometer tidak perlu lagi dibangun dengan teknik optika sinar ganda, melainkan cukup dengan teknik optika sinar tunggal (single beam optics). Nilai absorbansi dari sel referens disimpan di dalam memori. Nilai absorbansi sampel sesungguhnya diperoleh dengan mengurangi nilai absorbansi hasil pengukuran dengan nilai absorbansi referens tadi. Dengan menggunakan nilai absorbansi tadi, mikroprosesor dapat diperintahkan untuk menghitungnya menjadi nilai transmitansi, konsentrasi, ratio kandungan tertentu terhadap kandungan lainnya, dsb. Dengan demikian, informasi yang ingin dicari lewat pengukuran dapat langsung diperoleh.

Spektrofotometer produksi Amersham Biosciences memiliki feature/performance yang unik sesuai dengan kebutuhan instrumentasi untuk laboratorium Biologi modern, yakni:

1. a. Dibangun dengan menggunakan teknik optika sinar tunggal (single beam optics) yang dilengkapi dengan mikroprosesor, sehingga terbentuk kompak dan mudah dipindah-pindahkan.

b. kalibrasi sepenuhnya berjalan otomatis setiap kali instrumen dihidupkan sehingga hasil pengukuran terjamin ketepatannya (validasi data),

c.  error atau deviasi hasil pengukuran akibat komponen bergerak (moving parts) di dalam spektrofotometer dapat diminimalkan,

d.  selain nilai absorbansi, nilai transmitansi, konsentrasi, ratio konsentrasi kandungan bahan (misal, ratio DNA/protein), kemurnian dsb. dapat langsung diperoleh pada tampilan keluaran tanpa harus melakukan perhitungan secara manual seperti pada spektrofotometer generasi sebelumnya.

2.       Dibangun dengan menggunakan detektor fotodioda silikon. Dibandingkan dengan menggunakan detektor fotomultiplier, sistem dengan detektor fotodioda memiliki kelebihan dalam hal waktu pengukuran yang lebih singkat, energi listrik yang lebih rendah, dan juga rangkaian listrik yang lebih sedikit.

3.       Dibangun dengan menggunakan mikroprosesor yang dapat berkomunikasi dengan personal computer, sehingga instrumen dapat dioperasikan secara “stand-alone” atau dikontrol oleh personal computer. Modus operasi terakhir sangat bermanfaat karena dengan bantuan program SWIFT (keluaran dari Amersham Biosciences juga)

a.    metoda dan waktu pengukuran dapat direncanakan lebih mudah,

b.    database hasil pengukuran dapat dikerjakan dengan mudah,

c.    tersedia beberapa fasilitas untuk analisa data,

Analisa data lebih rinci dan komprehensif dapat dilakukan setelah pengukuran sehingga instrumen dapat lebih awet (ingat bahwa secara alami umur hidup lampu terbatas hanya berkisar 1000 jam).

Posted in: Ilmiah